支原體PCR檢測培養(yǎng)方法檢測結(jié)果
　　
　　支原體PCR檢測直接培養(yǎng)法
　　
　　原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。
　　
　　特點：是目前zui直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。
　　
　　缺點：培養(yǎng)時間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(例如M.hyorhinis)。需同時培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對照組，可能會造成污染。
　　
　　材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。）
　　
　　污染是細胞培養(yǎng)的大敵，預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細胞的關(guān)鍵之一。危機意識要貫徹實驗的始終，否則不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。
　　
　　支原體PCR檢測方法與結(jié)果：
　　
　　1，將已檢測出有支原體污染的細胞以正常傳代密度鋪到6孔板中，一個孔加清除劑，作為測試孔，另一孔不加清除劑，作為陰性對照孔。兩孔之間間隔一個孔，以免互相污染。
　　
　　2，在清除支原體的過程中細胞以常規(guī)方法傳代培養(yǎng)，并使細胞在培養(yǎng)過程中一直處于清除劑的作用下。在加清除劑后第4、8、9、11天各取1毫升培養(yǎng)上清。每份上清與細胞已共培養(yǎng)48小時，除第9天的上清只共培養(yǎng)了24小時。
　　
　　3，將這些培養(yǎng)上清在16000g離心5分鐘，小心去除離心上清，將沉淀用無菌PBS洗三次，每次以16000g離心5分鐘。zui后獲得的沉淀用100微升純水重懸，在100℃水浴中孵育5分鐘，然后用于PCR反應(yīng)。
　　
　　4，按照支原體檢測試劑盒的說明書進行PCR檢測操作，結(jié)果如下：
　　
　　4.1，與對照樣品共同反應(yīng)，用這種方式可以判斷是否出現(xiàn)了假陰性結(jié)果。在加清除劑后第4天的樣品中仍可見到支原體陽性條帶（約440bp），在第8、9、11天的樣品中，已看不到支原體陽性條帶。
　　
　　4.2，不加對照樣品，檢測樣品單獨反應(yīng)，用這種方式可以提高測試靈敏度?？梢娫诘?天和第9天的樣品中，支原體陽性條帶仍然出現(xiàn)，但是弱于第4天的樣品。在第11天的樣品中，有明顯的200bp以下的非特異的條帶，且亮度高于陽性條帶，所以判斷此時的PCR產(chǎn)物是非特異反應(yīng)的產(chǎn)物，樣品中已沒有支原體DNA。