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支原體檢測 常見答疑

更新時間:2020-06-15  |  點擊率:922

問:在用qEP做支原體檢測的時候,加入內(nèi)控對照品,在儀器設置上是需要選擇兩個通道嗎?

答:是需要2個通道,一個FAM, 一個HEXHEX是對應內(nèi)控的通道。

 

問:我想問一下,7500儀器里面沒有HEX這個通道選項,可以用哪個通道代替呢?

答:7500這款是沒有HEX熒光標識,不過問過廠家,說7500VIC,可以用VIC通道。

 

問:qPCR結(jié)果判定中,FAM positive,HEX irrelevant中這個不相關(guān)是具體指什么?

答:這個不相關(guān)是指如果FAM是陽性,那么由于擴增時存在競爭性抑制,所以內(nèi)控是否有擴增,其無關(guān)緊要。

 

問:在用樣品制備試劑盒時,進行支原體DNA提取時,加入內(nèi)控對照品,實際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA,而無法監(jiān)測這步操作的回收率的,是嗎?

答:“實際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA”,可以這么理解,或者說是在監(jiān)測整個提取過程。我們又問了一下廠家,內(nèi)控和樣品的提取效率是一樣的,這樣可以反映樣品的真實情況,因為只要內(nèi)控提取后能測出來,那就表明提取是沒有問題的。極少量的支原體如10CFU的,通過提取,也是可以檢測到的,表明靈敏度是沒有問題的。樣本Ct值和10CFUCt值比較,是可以進行相對定量的。

 

問:你們好,我問一下你們這個Venor Gem qEP試劑盒能做放行檢測嗎?

答:放行應相當于國外說的release testing, 這個qEP試劑盒是符合國外藥典規(guī)定的性能,能做放行檢測的。同時需注意要做支原體DNA抽提才行,抽提是用另外一個盒子,見廠家的venor gem sample preparation kit

 

問:這個如果是用來檢測細胞上清,是不是就不用提取DNA了呢?

答:只要是跟藥典有關(guān),跟臨床治療或制藥檢驗有關(guān),就需要提取DNA。如果僅僅是科研用培養(yǎng)細胞,篩查支原體,則可以不提。

 

問:詢問qPCR儀器的設置

答:具體可見MB廠家文件Venor®GeM qEP: Cyclers Programming,可從網(wǎng)站上下載。

 

問:被動參比染料是選none”吧?


 

答:對,沒有ROX,選none

 

問:大家好,想咨詢一下,咱們支原體DNA提取時所取的樣本量是依據(jù)什么定的呢,比如,我們有CAR-T細胞,病毒液等,如果CAR-T細胞按細胞數(shù)來的話取多少細胞數(shù)比較好,或者如果病毒液按體積的話多少體積更佳呢?

答:支原體 DNA 提取試劑盒可從多含有 1X 106細胞/ml 的細胞上清中直接分離 DNA,病毒沒有要求??傮w積多 200μl。提取的樣本就是細胞上清,ATMPs(高級醫(yī)用藥品),細胞培養(yǎng)基等。病毒液應該也是初來自細胞上清吧。樣本量是根據(jù)支原體污染量得出的經(jīng)驗值,跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關(guān)。

 

問:病毒液就是類似細胞上清的。如果體積大于200ul的話我們可以濃縮,但是這個體積有沒有一個上限呢?

答:體積有上限,是200 to 1000 µl, 可以參看經(jīng)典法試劑盒的那個說明書里對樣本處理那一塊。這個樣本量同時還考慮了靈敏度,使檢測達到很好的靈敏度。如果細胞數(shù)高于1X 106細胞/ml ,那必須要先調(diào)細胞數(shù)了?;蛘邷p少樣本體積,總細胞數(shù)不超,也行。

 

問:您好,我這邊要提取10cfu對照品的基因組,10cfu對照品的說明書寫著用1ml基質(zhì)重懸,基因提取試劑盒說一次上樣200μl進行提取,想問您一下,用200μl基質(zhì)重懸10cfu可以嗎,想一次提完。

答:還是建議用1ml的基質(zhì)重懸,因為靈敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul,濃度就高了。廠家建議10CFU標準品復溶了以后,要立即用完,不要再保存,擔心可能降解。

 

問:那1ml溶解的標準品,按提取試劑盒的要求,就得用多個管子一次提完對吧?

答:是的。

 

問:這個抽提試劑盒的收率有多少,是磁珠還是吸附柱?吸附柱的收率能有,因為以前我們用其他品牌的抽提試劑盒,收率只有百分之六,這樣的話,就存在假陰性結(jié)果的可能。

答:是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里,用的是很少量的支原體10CFU/ml,提取DNA后都可以檢測到。廠家來信說,產(chǎn)率依賴于DNA的類型(如GC含量,是基因組還是質(zhì)粒)、操作者的技巧以及樣本基質(zhì)的情況。因為這些情況,操作者很難達到生產(chǎn)商所給的比率,從而形成各種討論,因此產(chǎn)率沒寫到說明書里。

 

問:要檢測支原體的培養(yǎng)基中有酚紅,是否還需要抽提?

答:只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul,酚紅就不會對qPCR構(gòu)成問題。更高濃度的酚紅會引起基線偏移,造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查,則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產(chǎn)品放行檢查,則需要抽提了。細胞基質(zhì)的驗證總是要做的。

 

問:做qPCR,一個陰性對照Ct約為40,也有擴增曲線。是什么原因?

答:Ct值大于40可能是由于產(chǎn)生非特異性信號(如primer artefacts)以及極微小的污染所致。 但是,該結(jié)果是不具有可重復性的,因此結(jié)果仍然是陰性。

 

問:一步法的盒子的靈敏度是否總低于經(jīng)典法試劑盒?有沒有可能一步法的盒子也能檢測10CFU

答:廠家回復如下:意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查,經(jīng)典法為10ul,用于產(chǎn)品的放行檢測。檢測10CFU的標準品非常具有挑戰(zhàn)性。一步法因為樣本量不夠,很難達到10CFU/ml。如果客戶想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒,可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經(jīng)典法(不含酶)的交叉驗證確實做過,顯示同樣的靈敏度。但全套的驗證沒有做過。

 

問:支原體10cfu標準品是干粉吧? 配完后是多少體積?

答:是凍干粉,加基質(zhì)液后是1ML體積。

 

問:基質(zhì)液產(chǎn)品里帶嗎?

答:這個產(chǎn)品里不帶,是客戶自己要檢測哪類樣品,就用樣品里的基質(zhì)液(例如用的哪個培養(yǎng)基)

 

問:PCR經(jīng)典法,跑膠時體現(xiàn)1條陽性帶,是否代表PCR經(jīng)典法可以檢測多種支原體,無法區(qū)分支原體種類。

答:PCR經(jīng)典法,跑膠時為1條陽性帶,無法區(qū)分支原體種類,需要將擴增產(chǎn)物測序鑒定。

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