999国产精品999久久久久久,香港经典a毛片免费观看,国产av在线私拍,97se亚洲国产综合在线

當(dāng)前位置:首頁  >  技術(shù)文章  >  qPCR檢測支原體方法略述

qPCR檢測支原體方法略述

更新時間:2020-11-09  |  點擊率:854

和PCR比起來,qPCR不用跑膠,實時監(jiān)測擴(kuò)增狀況,操作更為便捷。下面以德國MB Venor®GeM支原體檢測試劑盒(qPCR一步法)Venor®GeM qOneStep)為例,略述檢測原理和過程。

 

   該試劑盒包括4管試劑,其中2管分別為緩沖液和PCR水,另2管為主要試劑。1管即mix,含引物、核苷酸、聚合酶、熒光素標(biāo)記的探針和內(nèi)部擴(kuò)增對照。另1管為陽性對照,均為凍干粉。

 

它通過擴(kuò)增高度保守的rRNA操縱子,或者更準(zhǔn)確地說,擴(kuò)增支原體基因組中的16S rRNA編碼區(qū),可以特異性地檢測支原體。在520nm(FAMTM通道)檢測支原體特異性擴(kuò)增片段。在610nm(HEXTM通道)檢測內(nèi)部擴(kuò)增對照的擴(kuò)增。它能特異性檢測所有導(dǎo)致細(xì)胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會被擴(kuò)增。通過內(nèi)部對照,可檢測PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結(jié)果。樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。檢測程序可在3小時內(nèi)完成。

在檢測前,樣本需要一定的制備。具體是將100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 ml反應(yīng)管中。關(guān)上蓋子扣緊。將樣品在95°C下孵育5分鐘。以大速度短暫離心樣品(15秒)以沉淀任何細(xì)胞碎片。然后可直接取2μl上清液進(jìn)行qPCR。

 

qPCR反應(yīng)體系一共是25ul,其中樣本2ul,其余是master mix。注意設(shè)置陽性對照、陰性對照(無模板對照)。

 

如果檢測的Ct<40,則表明PCR結(jié)果陽性。如果檢測的Ct≥40,則PCR反應(yīng)結(jié)果為陰性。如果FAM陽性,則支原體陽性。如果FAM陰性,HEX也陰性,表明PCR擴(kuò)增出了問題,需要重做。如果FAM陰性,HEX陽性,表明支原體確實陰性。

 

PCR擴(kuò)增出了問題主要原因為PCR反應(yīng)被抑制了,可能需要考慮做DNA抽提。

 

在qPCR反應(yīng)中,引物和探針的設(shè)計尤為重要,它既需要覆蓋大多數(shù)支原體,又需要不與細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然,Taq酶的性能也很重要,因為DNA的擴(kuò)增終依賴于酶的活性和擴(kuò)增的速度。從這個角度說,一個好的qPCR試劑盒是各個因素共同作用的結(jié)果。

亚洲AV无码不卡久久| 无套熟女av呻吟在线观看| 纤夫的爱在线观看完整版动漫| 色欲久久综合亚洲精品蜜桃| 无遮挡很黄很黄的视频| 无码任你躁久久久久久| 精品国产免费一区二区三区| 亚洲AV成人综合网| 亚洲av无码一区二区三区在线 | 久久久久久久波多野结衣高潮| 狠狠色综合网久久久久久| 武侠 欧美 另类 人妻| 久久99精品久久久久子伦| 国产精品 精品国内自产拍| 一本一道色欲综合网中文字幕| 黄瓜视频在线观看| 青青草视频在线观看| 久久蜜桃精品一区二区三区| 无码aⅴ免费中文字幕久久| 国产又大又粗又长硬又紧又爽| 精品无码乱码av| 久久aⅴ无码av高潮av喷吹| 99热精品久久只有精品| 久久精品国产精品亚洲蜜月| 久久人人做人人妻人人玩精品VA| 免费b站推广网站| 日本三级在线观看免费| 日本大但人文艺术| 国产精品久久久久久婷婷| 丰满少妇被猛烈进入| 女人国产香蕉久久精品软件| 欧美精产国品一二三产品工艺| 高傲人妻女教师的沉沦长篇| 亚洲日韩国产精品乱-久| 人妻激情另类乱人伦人妻| 日本三级丰满邻居人妻视频| 色偷拍 自怕 亚洲 10p| 麻花传媒剧在线mv免费观看| 亚洲爆乳无码一区二区三区| 国产精品人妻无码77777| 精品麻豆国产色欲色欲色欲WWW|