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「支原體qPCR檢測」的方法學(xué)驗證

更新時間:2020-12-28  |  點擊率:1298

在生物制品和細(xì)胞治療領(lǐng)域,支原體檢查是保證產(chǎn)品和治療安全的重要一環(huán)。生物源性原材料、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體,以及細(xì)胞或基因治療產(chǎn)品在生產(chǎn)過程的不同階段都要進(jìn)行支原體污染的檢查。

傳統(tǒng)支原體檢查方法是培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法,并為藥典所認(rèn)可和收錄。近年來,『支原體qPCR檢測』在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多,但在項目申報前,先需要進(jìn)行方法學(xué)驗證,依據(jù)藥典,在檢測限、特異性和耐用性方面達(dá)到要求后,才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。

 

就筆者所知,在適合工業(yè)的支原體檢測和方法驗證方面,德國Minerva Biolabs(簡稱MB)公司已有很成熟的產(chǎn)品及商業(yè)化應(yīng)用,它不僅提供有符合藥典的『支原體qPCR檢測』試劑盒,而且有一系列支原體標(biāo)準(zhǔn)品及輔助產(chǎn)品,用于qPCR方法的全面驗證。這些產(chǎn)品性價比也較高,許多客戶都在使用。

 

下面,筆者就『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』的方法驗證產(chǎn)品闡述如下。

 

 

一、『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求

 

各國藥典對支原體核酸擴(kuò)增檢測方法(簡稱NAT法)的驗證要求略有出入,但均要求對檢出限、特異性和耐用性進(jìn)行驗證。在檢測方法上,均要求先做樣本的支原體DNA抽提,再進(jìn)行支原體檢測。

 

如使用商品化試劑盒,則除了需要試劑盒生產(chǎn)商提供完整的方法學(xué)驗證數(shù)據(jù)外,還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性,以及試劑盒表現(xiàn)出預(yù)期的性能(例如檢測限、耐用性、是否存在與細(xì)菌的交叉反應(yīng))。這些必須由使用者自己來證明。

 

在檢出限驗證中,歐洲藥典(簡稱EP)規(guī)定了污染細(xì)胞的常見9種支原體,要求NAT如替代培養(yǎng)法,對這9種支原體的檢測限需均達(dá)到10CFU/ml。其中如果生產(chǎn)中未采用昆蟲或植物源材料,可不必檢檸檬螺原體(Spiroplasma citri);如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料,可不必檢關(guān)節(jié)液支原體(M. synoviae)。

 

日本藥典(簡稱JP)中的驗證要求與EP基本一致,但在檢出限驗證中,JP 17未提及雞敗血支原體,但增加了唾液支原體的驗證。

 

終待驗證的支原體物種的選擇,在依據(jù)藥典基礎(chǔ)上,還需根據(jù)支原體污染風(fēng)險大小而定。污染風(fēng)險的影響因素有支原體寄生的宿主細(xì)胞的特異性、原材料的來源、產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域等。

 

德國MB公司提供有10CFUTM支原體高敏標(biāo)準(zhǔn)品,可同時用于檢測限和耐用性的驗證。

 

關(guān)于檢測限和耐用性的檢測次數(shù),有如下公式可參考:

檢測次數(shù) = 支原體物種數(shù) × 3 輪獨立檢測 × 8個復(fù)孔/每個物種/每輪

 

以歐洲藥典規(guī)定的9種支原體為例,實際所需檢測次數(shù)為9 × 3 × 8 = 216 次檢測。

 

加上陰性對照、陽性對照、無模板對照以及特異性驗證,預(yù)計規(guī)格為250次/盒的試劑盒較為適合。

 

在NAT法的特異性驗證方面,歐洲藥典EP2.6.7指出,梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系,應(yīng)優(yōu)先選擇進(jìn)行驗證。

 

至于更具體的驗證方案,還需要使用者針對自己的產(chǎn)品以及流程自行設(shè)計,德國MB公司也可協(xié)助完善。

 

二、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』方法的驗證產(chǎn)品

 

下面列出的方法驗證所需產(chǎn)品,具體有四個表,供使用者參考:

 

表1.『支原體qPCR檢測』方法驗證所需產(chǎn)品

 

表2. 特異性驗證用標(biāo)準(zhǔn)品

根據(jù)EP2.6.7,梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系,適合用于特異性驗證。因此下表列出的是這3個菌屬的產(chǎn)品。用戶也可選擇自己生產(chǎn)過程中可能會遇到的細(xì)菌進(jìn)行特異性驗證。

 

表3. 其他輔助產(chǎn)品

 

表4. qPCR方法驗證所需設(shè)備、儀器

 

希望以上信息能給您帶來幫助。

如您對以上產(chǎn)品感興趣,需要訂購或進(jìn)一步咨詢詳情,請聯(lián)系德國MB中國區(qū)總代理:北京締一生物科技有限公司。

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