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為確定有無支原體污染該做哪些檢測?

更新時間:2021-10-15  |  點擊率:717

為確定有無支原體污染可做如下檢測:

1.相差顯微境檢測

將細(xì)胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上,24h后取出,用相差油鏡觀察,支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。

2.熒光染色法

熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258,可使支原體內(nèi)含有的DNA著色,染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下:首先將細(xì)胞接種蓋玻片上,在細(xì)胞未長滿前取出玻片,用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下,用l: 3醋酸甲酵固定10Min,然后用生理鹽水漂洗,置于用生理鹽水配濃度為50pg/ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min,向細(xì)胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴,然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點。

3.電鏡檢查

用掃描電鏡方法簡便快速,也可以利用透射電鏡。

4.DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法

檢出率高,但方法較為復(fù)雜。

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物,大小一般在0.3-0.5μm之間,呈高度多形性,有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細(xì)胞,也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色,用姬姆薩染色很淺,革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細(xì)胞培養(yǎng)中生長,營養(yǎng)要求比細(xì)菌高。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中,主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染:控制環(huán)境污染;嚴(yán)格實驗操作;細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無菌;在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

1、支原體檢測

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記,使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光,利用熒光信號的變化和配套軟件,進行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測,簡稱qPCR。

優(yōu)點:①靈敏度高、特異性強。

②時間短,2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點:①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。(可用培養(yǎng)法做補充驗證)

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同),需謹(jǐn)慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

德國MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測試劑盒(均為探針法檢測),依據(jù)操作步驟的細(xì)微差別,

分『經(jīng)典法』和『一步法』兩種。

2、環(huán)境空間消毒方案

試驗臺、超凈臺、培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器、門把手、電話等細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

被支原體污染,可引起細(xì)胞的污染。應(yīng)定期對工作區(qū)域進行消毒。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑,或濕巾擦拭 5-10分鐘清除,對支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性,操作簡單方便。

截圖20211015090715.png

qPCR法介紹:

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記,使PCR擴增后的產(chǎn)物帶有熒光,利用熒光信號的變化和配套軟件,進行DNA擴增反應(yīng)的實時監(jiān)測,簡稱qPCR。

優(yōu)點:①靈敏度高、特異性強。

②時間短,2-3小時出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點:①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。(可用培養(yǎng)法做補充驗證)

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同),需謹(jǐn)慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。


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