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細胞的增值與傳代

更新時間:2021-12-15  |  點擊率:933

培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、器皿或其他容器,生存空間及營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖到一定密度后,分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液,使細胞更好地生存,這一過程稱之為“傳代"(passage或subculture)。

值得注意的是:每次傳代細胞在生長和增殖方面受到一定的影響。

生命期

指細胞在培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時間。一般根據(jù)細胞種類、性狀和原供體的年齡的情況而定。

如:二倍體成纖維細胞,在不凍存和反復傳代條件下可傳30~50代,相當于150~300個細胞增殖周期,能維持一年左右的生命,細胞便開始凋亡(apoptosis)。 細胞在生存過程中經(jīng)歷以下三個階段

1.原代培養(yǎng)期(primary culture)

細胞培養(yǎng)

組織到第一次傳代時間大約為1~4周

特點:

細胞移動活躍,但分裂不旺盛,多呈二倍體核型。

原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結構和功能活動基本相似。

各細胞的遺傳性狀互不相關,細胞相互依存性強,如果把這種稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),細胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降,表明細胞獨立生存性差。

2.傳代期(passage)

初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代便稱之為細胞系(cell line)

特點:

細胞增殖旺盛,并維持二倍體核型,也叫二倍體細胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細胞性質(zhì),細胞應在初代或傳代早期凍存為好。

一般細胞在10代以內(nèi)凍存。

凍存配方:

向培養(yǎng)液加入保護劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

存于在液氮中溫度可達到-196℃,可長期儲存。如解凍后細胞復蘇,仍能繼續(xù)增殖生長,細胞性狀不受影響,成為保存細胞最主要的手段。

3.衰退期

特點:細胞仍生存 增殖減慢 不增殖 輪廓增強 衰退凋亡

注意:細胞在三期中的任何一期(一般發(fā)生在傳代后期或衰退期)在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneous transformation);

細胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性性(malignancy)。細胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細胞群體稱為連續(xù)細胞系(continuous cell line)。而細胞獲得不死性后,細胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

生存期

細胞增殖

“ 一代"指細胞接種到分離再培養(yǎng)的所用的時間。與細胞倍增一代不是一個含義。在細胞一代中,細胞能倍增3~6次,經(jīng)歷三個階段:

1. 潛伏期(latent phase) :

接種 經(jīng)過 懸浮期(細胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形) 貼壁。

初代培養(yǎng)細胞 經(jīng)過 10~24小時或更多時間。

連續(xù)細胞系和癌細胞系 經(jīng)過 10~30分鐘 貼附。

貼附現(xiàn)象是一個非常復雜和受多種因素的影響。

影響細胞貼附:底物表面不干凈,影響細胞貼附。

利于細胞貼附:底物表面帶有陽性物質(zhì)與特殊物質(zhì):

纖粘連蛋白(fibronectin FN)、

細胞表面蛋白(cell surface proteinCSP)

這些物質(zhì)有的存在與細胞表面,有的來自血清。

潛伏期特點:

長短與細胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關。

(1)細胞貼附后進入潛伏期,細胞無增殖。少見分裂相,細胞有運動活動。

(2)初代培養(yǎng) 細胞潛伏期約為24~96小時或更長,

連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期約6~24小時。

(3)細胞接種密度大潛伏期短。

(4)細胞出現(xiàn)分裂相增多時,標志細胞進入指數(shù)增生期。

2.指數(shù)增生期(logarithmic growth phase):

特點:細胞增殖最旺盛階段,分裂相增多。

細胞分裂指數(shù)(mitotie index MI) :

表示每1000個細胞中的分裂相數(shù)。

條件:分裂相數(shù)與細胞種類、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關。

細胞分裂指數(shù):

初代細胞:在0.1%~0.5%之間% ,

連續(xù)分裂細胞和腫瘤細胞:3 ~5%。

指數(shù)增生期是作為細胞一代活力好的時期,是進行實驗最好和最主要的階段。

指數(shù)增生期持續(xù)3~5天,細胞數(shù)量增多后生長空間變小,細胞相互接觸可連接成片。

正常細胞:細胞相互接觸能抑制細胞運動,這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contact inhibition)。

腫瘤細胞:沒有這種現(xiàn)象,可作為區(qū)別正常與腫瘤細胞的標志之一。當腫瘤細胞達到一定密度后向三維空間發(fā)展,使細胞發(fā)生堆積(piled up)。

由于細胞不斷增殖分裂,細胞數(shù)量持續(xù)增多,培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多,細胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density inhibition),導致細胞分裂停止。

3.停滯期(stagnate phase)

細胞量和密度達到飽和,細胞停滯增殖。表明細胞進入到停滯期,細胞數(shù)量持平,也稱為平頂期(plateau)。

特點:細胞不增殖,有代謝活動。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低,此時需要傳代,否則細胞將會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細胞會從底物脫落死亡。

注意:

傳代過晚將影響下一代細胞的生長,至少要再傳 1~2代 ,通過換液淘汰死細胞和受損較輕的細胞。待細胞全部恢復后再用。

在這一點上要特別注意。

科研實驗中,細胞的體外培養(yǎng)一直是一個重要環(huán)節(jié)。細胞要養(yǎng)好,就要用好血清,如Ausbian®特級胎牛血清,它適合各種細胞培養(yǎng),尤其適合難養(yǎng)細胞,如:干細胞、肝細胞,神經(jīng)細胞,原代培養(yǎng)、細胞融合、轉(zhuǎn)染細胞等。

Ausbian®特級胎牛血清所有血清出廠前,均經(jīng)過嚴格質(zhì)控,每個批次附有詳細完整的《檢測報告》,包括:品名,貨號,批號,血源地,生產(chǎn)日期,保質(zhì)期,pH值、滲透壓、血紅蛋白、總蛋白、球蛋白、IgG、內(nèi)毒素、無菌檢查(細菌、真菌、支原體)、病毒檢查(如BVD、牛腺病毒、細胞病變效應等)、促細胞生長能力、細胞毒性、BVD-1/2抗體檢查等。


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