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細胞培養(yǎng)的具體步驟是什么?

更新時間:2022-01-04  |  點擊率:813

細胞培養(yǎng)技術指的是細胞在體外條件下的生長,在培養(yǎng)的過程中細胞不再形成組織(動物)。培養(yǎng)物是單個細胞或細胞群。細胞在培養(yǎng)時都要生活在人工環(huán)境中,由于環(huán)境的改變,細胞的移動或受一些其他因素的影響,培養(yǎng)時間加長,傳代導致細胞出現(xiàn)單一化型。

一、細胞復蘇

將凍存細2113胞從液氮5261中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融4102化。移人15ml離心管中,加入10ml預熱1653的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。

加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10mlDMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時.去培養(yǎng)基,10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉移至15ml離心管。

加入10mlPBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10mlPBS(經(jīng)高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進行計數(shù),按照1×106/盤接種,在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%~90%時,去培養(yǎng)基,10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細胞培養(yǎng)盤,轉移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。

加入lml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi)(盒內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內(nèi),過夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。

凍存液的配制:70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。


科研實驗中,細胞的體外培養(yǎng)一直是一個重要環(huán)節(jié)。細胞要養(yǎng)好,就要用好血清,如Ausbian®特級胎牛血清,它適合各種細胞培養(yǎng),尤其適合難養(yǎng)細胞,如:干細胞、肝細胞,神經(jīng)細胞,原代培養(yǎng)、細胞融合、轉染細胞等。


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