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PCR實驗的污染來源都有哪些?

更新時間:2022-05-17  |  點擊率:1088

PCR實驗的污染來源都有哪些?

樣本間交叉污染:收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴導致外溢;不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖;移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌;不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散,相互交叉污染。

實驗試劑污染:主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中,由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。加樣過程中,因為PCR試劑對溫度十分敏感,需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃,但這個過程也充滿污染風險。

擴增產物污染:大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋,這是PCR反應中最主要、最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可形成假陽性。

那么對于【細胞和生物制品】及其生產過程中【支原體】污染的檢測,有什么PCR檢測方法嗎?

  • 常規(guī)PCR Kit (經典法)(不含Taq酶)

特點

1.內控對照為獨立包裝,遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2.高特異性,僅一條陽性對照條帶,即可涵蓋所有可能感染細胞的支原體物種。操作簡單,

易于觀察。

3. 高靈敏度,若PCR反應體系加入10μl樣本,支原體檢測限度為≤5或≤10CFU。

(詳見下文“(2)Venor® Gem Classic Kit 10種常見支原體檢測限“)

4.歐洲藥典要求的26種支原體均可檢出。該試劑盒可檢測出1種脲原體、7種無膽甾原體和85種支原體,與細菌和真核DNA無交叉反應。

5.試劑盒中不含Taq酶,可另外購買。推薦使用德國MB公司專用Taq酶。(貨號: 53-1050)


Venor® Gem Classic Kit

10種常見支原體檢測限


PCR實驗的污染來源都有哪些?


操作步驟

第1步:樣本處理

a. 細胞培養(yǎng)上清

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b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明:①樣品基質可能會影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原DNA,影響檢測靈敏度。

建議:樣本做DNA抽提處理,實現最高靈敏度。

推薦:德國MB公司生產的專用支原體DNA提取試劑盒,Venor® Gem Sample Preparation Kit。該DNA抽提試 劑盒已經過廣泛驗證。

第2步:試劑制備

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第3步:PCR體系建立

a. 細胞培養(yǎng)上清

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b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

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第4步:啟動PCR反應


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第5步:電泳結果分析

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191bp為內控對照條帶,表明PCR反應正常。

當樣本存在支原體污染時,由于內控對照與支原體DNA存在競爭,內控對照條帶變弱(例如支原體DNA>103拷貝)。

陽性對照中支原體DNA>104拷貝,內控對照條帶會*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶,此條帶不影響檢測結果。

如果待測樣本對PCR產生抑制,則內控對照條帶變弱(和陰性對照相比),此時應先進行DNA抽提(推薦使用:Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒,詳見第25頁),然后再檢測。

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儲存條件

2~8℃至少6個月。復溶后在-18℃保存。


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