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PCR Clean™玻璃表面dna酶的祛除能力如何?

更新時間:2024-12-27  |  點擊率:168

德國Minerva Biolabs公司提供的PCR Clean™針對實驗室常用的核酸污染祛除試劑,對比其濕巾和噴霧劑在常見的儀器、物品的污染祛除效果進行了檢測,并對其結果進行了詳細的闡釋。


科研人員測試了PCR Clean™和PCR Clean™Wipes對玻璃表面dna酶的祛除能力。簡而言之,DNase I(1µl, 3u /µl, Applichem, Cat.;將No.A3778.0010)移液到玻璃表面風干。接下來,用干紙巾、70%異丙醇浸泡液、PCR Clean™浸泡液或PCR Clean™ Wipes擦拭。


使用基因組DNA (gDNA)標準物作為底物/指示劑,通過qPCR間接測量DNA酶的酶活性來鑒定持續(xù)的DNA酶污染。

簡單地說,在擦拭步驟后,將20µl gDNA (M.gallisepticum,10^3個基因組拷貝/µl, 10mM MgCl2在PCR級水中)添加到DNA預包被的點上。

然后通過上下移液10次收集污染的DNase及其底物gDNA的混合物,并在37°C下孵育15分鐘,以允許酶促反應(消化)發(fā)生。

然后通過評估m(xù)icrostart®ATMP支原體(Sartorius STEDIM Biotech) qPCR擴增的性能來推斷由于污染DNA酶引起的相關DNA降解。作為qPCR反應wan quan受損的參考,科研人員納入陽性對照,采用20µl的gDNA(10^3個基因組拷貝/µl)在37℃下孵育15分鐘,獲得陽性對照。同樣的程序用于產生陰性對照,不添加DNase I。


實驗結果,在用不同方法進行去污后,通過在DNase污染點上添加gDNA(雞毒支原體,103 C/µl)的qPCR來評估DNase(3 U)的有效祛除率。

在qPCR之前,從污染的玻璃表面收集gDNA和DNase的混合物,并在酶反應的**條件下孵育。當沒有觀察到qPCR反應受影響時,認為凈化完成。這是通過用PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕的紙巾擦拭來實現(xiàn)的,正如成功擴增摻入的gDNA所證明的那樣。

從PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕紙巾處理過的表面樣本中,獲得的摻入gDNA的Ct值與陰性對照相當,在gDNA摻入之前沒有吸過DNase(表5)。

省略擦拭步驟,使用干燥的紙巾或用70%異丙醇潤濕的毛巾,通過之前添加的DNase誘導gDNA大量降解(無Ct,表5)。在陽性對照組中觀察到類似的wan quan降解,在**反應條件下允許DNases誘導的DNA降解發(fā)生。圖5顯示了閾值以上的清晰擴增曲線,僅適用于經PCR Clean™處理的表面和陰性對照,從而證實了qPCR性能因所用祛除劑而異。


表5.使用隨后的DNA回收作為去污效率的指標,在表面清潔后殘留的DNA酶活性。該表顯示了與對照組相比,摻入DNase預涂玻璃表面的gDNA的qPCR Ct值,后來用幾種方法擦拭。通過**酶消化(陽性對照)獲得的擴增缺失(無Ct)表明DNA明顯依賴于DNA酶降解,阻礙了qPCR。同樣,低效的凈化方法也會導致qPCR受損。斑點靶標的成功擴增(在陰性對照的2 Ct值內)表明,之前污染的DNase被顯著祛除。


圖5.在應用了幾種清潔方法后,在DNase污染的玻璃表面上添加gDNA的qPCR擴增曲線與對照條件進行了比較(詳見下文圖例)。



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