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細(xì)胞總培養(yǎng)不好,你考慮過是支原體在作亂嗎

更新時(shí)間:2021-01-20  |  點(diǎn)擊率:890

實(shí)驗(yàn)室里總會(huì)有各式各樣的細(xì)胞需要培養(yǎng),養(yǎng)細(xì)胞的會(huì)發(fā)生一些囧事:不做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,細(xì)胞長(zhǎng)得老快了;一到做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,自家的細(xì)胞好像吃了瞌睡藥一樣,昏昏欲睡,死活長(zhǎng)不起來。

導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的常見原因:
  • 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢;
  • 細(xì)胞變形;
  • 碎片增加;
  • 懸浮細(xì)胞容易成團(tuán);
  • 培養(yǎng)基提前變色;
  • 鏡下發(fā)現(xiàn)有小黑點(diǎn);

如果排除了其他試劑選擇不當(dāng)、細(xì)胞株老化、細(xì)菌污染……原因,而仍有上述一種或幾種情況,則高度提示:細(xì)胞可能出現(xiàn)了支原體污染。據(jù)報(bào)道,細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生支原體污染的機(jī)率較高,會(huì)達(dá)到70%左右,常規(guī)抗生素的使用對(duì)支原體幾乎無效。

那么,支原體污染,對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有什么危害呢?

 

支原體穿透真核細(xì)胞表面 大量支原體聚集在真核細(xì)胞表面(掃描電鏡照片)

細(xì)胞被支原體污染,解決方案:

方法一:確認(rèn)細(xì)胞已被支原體污染,終止試驗(yàn),丟棄所有被污染的細(xì)胞和耗材。

重新復(fù)蘇細(xì)胞,注意選用未被污染的細(xì)胞株、血清和培養(yǎng)基,并規(guī)范操作。

方法二:對(duì)于珍貴的,樣品不可再得的細(xì)胞,或價(jià)格昂貴的種子細(xì)胞,不但無法丟棄,而且作為種子細(xì)胞,還需要**支原體污染。

此時(shí),需選用特異性的支原體殺除劑,清除污染,保護(hù)細(xì)胞。

目前世界上效的方法是是德國(guó)的一款生物試劑,由Minerva公司生產(chǎn),品名Mynox®。

此試劑可在2-3小時(shí)內(nèi)將支原體主動(dòng)殺除,但對(duì)細(xì)胞無毒害作用。特別適合細(xì)胞保種。

Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑,加入培養(yǎng)液中,可特異性地與支原體膜結(jié)合,改變膜通透性。通過此生物物理的方法,2~3小時(shí)內(nèi),即可把細(xì)胞中的支原體殺除掉。因?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)與支原體膜不同,故Mynox®不會(huì)與細(xì)胞膜結(jié)合,因此無細(xì)胞毒性。

注意:3小時(shí)后,需將此試劑洗脫,將細(xì)胞更換到新的培養(yǎng)耗材和培養(yǎng)液中,重新培養(yǎng)。

此時(shí),不應(yīng)使用PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中支原體。由于支原體解體,故PCR結(jié)果為假性強(qiáng)陽(yáng)性。

具體操作流程見下圖:

 

Mynox®祛除貼壁細(xì)胞中支原體的流程圖

Mynox®殺除支原體功能強(qiáng)大有效,但由于價(jià)格昂貴,上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右,使得應(yīng)用于細(xì)胞保種的數(shù)量受到價(jià)格的限制。

方法三:對(duì)于已耗費(fèi)很多時(shí)間,大量擴(kuò)增起來的細(xì)胞,或經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過的細(xì)胞,如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染了,怎么辦?此時(shí)由于前期工作量巨大,使操作人員無法丟棄已有細(xì)胞。

但由于價(jià)格原因,又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細(xì)胞上的支原體,

同時(shí),實(shí)驗(yàn)人員還需要清除細(xì)胞上的支原體污染,讓實(shí)驗(yàn)得以往下推進(jìn),以終獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

此時(shí),實(shí)驗(yàn)者可選用對(duì)支原體*的抑制劑,通過對(duì)細(xì)胞的前期處理,中期加藥,逐步通過4代左右的培養(yǎng),得以將支原體污染*清除,確保試驗(yàn)順利推進(jìn),結(jié)果準(zhǔn)確。

細(xì)胞培養(yǎng)中,支原體污染發(fā)生頻繁。有時(shí)帶來的危害會(huì)造成實(shí)驗(yàn)的巨大損失。應(yīng)經(jīng)常檢測(cè)和及時(shí)排除支原體污染,讓細(xì)胞在健康安全的環(huán)境下生長(zhǎng),為獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,打下良好的基礎(chǔ)。

 

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