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細胞總培養(yǎng)不好,你考慮過是支原體在作亂嗎

更新時間:2021-01-20  |  點擊率:893

實驗室里總會有各式各樣的細胞需要培養(yǎng),養(yǎng)細胞的會發(fā)生一些囧事:不做實驗的時候,細胞長得老快了;一到做實驗的時候,自家的細胞好像吃了瞌睡藥一樣,昏昏欲睡,死活長不起來。

導(dǎo)致細胞生長緩慢的常見原因:
  • 細胞生長緩慢;
  • 細胞變形;
  • 碎片增加;
  • 懸浮細胞容易成團;
  • 培養(yǎng)基提前變色;
  • 鏡下發(fā)現(xiàn)有小黑點;

如果排除了其他試劑選擇不當(dāng)、細胞株老化、細菌污染……原因,而仍有上述一種或幾種情況,則高度提示:細胞可能出現(xiàn)了支原體污染。據(jù)報道,細胞培養(yǎng)中發(fā)生支原體污染的機率較高,會達到70%左右,常規(guī)抗生素的使用對支原體幾乎無效。

那么,支原體污染,對細胞培養(yǎng)有什么危害呢?

 

支原體穿透真核細胞表面 大量支原體聚集在真核細胞表面(掃描電鏡照片)

細胞被支原體污染,解決方案:

方法一:確認細胞已被支原體污染,終止試驗,丟棄所有被污染的細胞和耗材。

重新復(fù)蘇細胞,注意選用未被污染的細胞株、血清和培養(yǎng)基,并規(guī)范操作。

方法二:對于珍貴的,樣品不可再得的細胞,或價格昂貴的種子細胞,不但無法丟棄,而且作為種子細胞,還需要**支原體污染。

此時,需選用特異性的支原體殺除劑,清除污染,保護細胞。

目前世界上效的方法是是德國的一款生物試劑,由Minerva公司生產(chǎn),品名Mynox®。

此試劑可在2-3小時內(nèi)將支原體主動殺除,但對細胞無毒害作用。特別適合細胞保種。

Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑,加入培養(yǎng)液中,可特異性地與支原體膜結(jié)合,改變膜通透性。通過此生物物理的方法,2~3小時內(nèi),即可把細胞中的支原體殺除掉。因為細胞膜結(jié)構(gòu)與支原體膜不同,故Mynox®不會與細胞膜結(jié)合,因此無細胞毒性。

注意:3小時后,需將此試劑洗脫,將細胞更換到新的培養(yǎng)耗材和培養(yǎng)液中,重新培養(yǎng)。

此時,不應(yīng)使用PCR方法檢測細胞中支原體。由于支原體解體,故PCR結(jié)果為假性強陽性。

具體操作流程見下圖:

 

Mynox®祛除貼壁細胞中支原體的流程圖

Mynox®殺除支原體功能強大有效,但由于價格昂貴,上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右,使得應(yīng)用于細胞保種的數(shù)量受到價格的限制。

方法三:對于已耗費很多時間,大量擴增起來的細胞,或經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過的細胞,如果發(fā)現(xiàn)細胞被支原體污染了,怎么辦?此時由于前期工作量巨大,使操作人員無法丟棄已有細胞。

但由于價格原因,又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體,

同時,實驗人員還需要清除細胞上的支原體污染,讓實驗得以往下推進,以終獲得準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)。

此時,實驗者可選用對支原體*的抑制劑,通過對細胞的前期處理,中期加藥,逐步通過4代左右的培養(yǎng),得以將支原體污染*清除,確保試驗順利推進,結(jié)果準(zhǔn)確。

細胞培養(yǎng)中,支原體污染發(fā)生頻繁。有時帶來的危害會造成實驗的巨大損失。應(yīng)經(jīng)常檢測和及時排除支原體污染,讓細胞在健康安全的環(huán)境下生長,為獲得準(zhǔn)確的實驗結(jié)果,打下良好的基礎(chǔ)。

 

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