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支原體DNA提取——德國(guó)MB Venor GeM Sample preparation Kit使用指南

更新時(shí)間:2023-09-29  |  點(diǎn)擊率:520

研究表明,37%的細(xì)胞培養(yǎng)上清和幾乎所有的混合細(xì)胞培養(yǎng)上清,都存在抑制PCR的物質(zhì)。因此,在對(duì)細(xì)胞或者細(xì)胞產(chǎn)物,進(jìn)行支原體PCR檢測(cè)前,需要進(jìn)行DNA提取。


產(chǎn)品名稱:支原體DNA抽提試劑盒

英文:Venor®GeM Sample preparation Kit    

品牌:Minerva-Biolabs®    

貨號(hào):56-1010

規(guī)格:10次/盒    



產(chǎn)品用途

細(xì)胞培養(yǎng)基隨著時(shí)間的延長(zhǎng),可能積聚抑制 PCR 的物質(zhì)。

已知血清含量大于 12%的培養(yǎng)基 對(duì)下游操作(例如 PCR)有抑制作用。而且,培養(yǎng)基中的酚紅,對(duì) qPCR 的熒光檢測(cè)也可能發(fā)生交叉反應(yīng),產(chǎn)生假陽性。這些弊端可通過支原體 DNA 提取試劑盒來克服 

從細(xì)胞培養(yǎng)物和生物藥中提取支原體 DNA,和支原體檢測(cè)試劑盒配套使用。提高支原體檢測(cè)的靈敏度、一致性和特異性。


作用原理

該試劑盒對(duì)支原體DNA的提取,主要由以下四步組成:

1、細(xì)胞裂解

2、DNA 吸附到核酸純化柱上

3、去除殘留污染物和抑制劑

4、DNA 洗脫。此方法無須酚/氯仿抽提,只需 30 分鐘即可完成制備,提供 PCR所需的 DNA。




使用方法

一、樣本要求


支原體 DNA 提取試劑盒可從數(shù)量上限為 1X 10^6 細(xì)胞/ml,體積上限為 500μl的細(xì)胞上清中,直接分離 DNA。 

通常,細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)盡快進(jìn)行 DNA 抽提。

在 95℃加熱 10 分鐘以使之穩(wěn)定,繼而在室溫可放 1 周。富含蛋白的樣本(蛋白含量>10mg/ml)可能需要蛋白酶 K 處理后,再抽提 DNA(請(qǐng)參照后面的流程)。注意,此試劑盒不適于提取真核細(xì)胞組織的 DNA。



二、操作步驟


新試劑盒拆封后,向緩沖液 A1 和緩沖液 A2 加入無水乙醇。將恒溫儀設(shè)置到 70℃。使緩沖液 E 加熱到 70℃。

1、200μl 樣本+200μl 調(diào)節(jié)液,渦旋振蕩 10 秒。

2、搖 床 孵 育70℃,10 分鐘。

3、加 400μl 吸附緩沖液,渦旋振蕩 10 秒。

4、將液體轉(zhuǎn)移到核酸純化柱,離心10000g,1 分鐘,棄掉流過的液體。

5、加500μl緩沖液A1,離心10000g,1 分鐘,棄掉流過的液體。

6、加500μl緩沖液A2,離心10000g,1 分鐘,棄掉流過的液體。

7、最大速度離心,3 分鐘

8、換管。

9、加 60μl 緩沖液E,孵育 2 分鐘。

10、離心8000g,2分鐘。

11、DNA即可用于PCR。



三、注意事項(xiàng)


??提供的試劑不能和其他批號(hào)的試劑混和。

??使用的試劑不要超過效期。 

規(guī)范操作流程,任何提取流程上的偏差都會(huì)影響到結(jié)果。 

??我們推薦使用對(duì)照品,以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。它也有助于排除故障。 

??不要使用其他酒精來替代乙醇,它將導(dǎo)致核酸產(chǎn)量的下降。 

??緩沖液 E 的預(yù)熱,會(huì)很大程度上改善核酸的產(chǎn)量。



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