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支原體qPCR檢測——Venor Gem qEP的使用前準備

更新時間:2023-09-30  |  點擊率:556

支原體檢測的應用

支原體是細胞實驗中,常見的一類污染物。

在干細胞治療、免疫細胞治療、CAR-T、抗體藥生產、疫苗生產相關的等臨床臨床項目,以及細胞典藏等重大的細胞培養(yǎng)項目,都需要進行支原體放行檢測,以確保產物沒有支原體污染。

?因此,需要建立結果準確、靈敏度高、操作簡便快捷、通過《藥典》方法驗證的檢測手段。

產品名稱:支原體qPCR檢測試劑盒 (經典法)

英文:Venor®Gem qEP    

貨號:11-9025    

品牌:Minerva Biolabs®    

規(guī)格:25次/盒    

特點:遵循歐洲藥典和日本藥典檢查的流程,通過方法學驗證;靈敏度高;特異性強,操作便捷。



產品用途


德國Minerva Biolabs公司的Venor® GeM qEP kit,用于定量檢測細胞培養(yǎng)物,及其他生物基質中的柔膜體綱微生物,如支原體、無膽甾原體、螺原體。

作用原理


通過擴增16S rRNA編碼區(qū)特異性檢測支原體,而真核生物和其他細菌DNA不能通過Venor®GeM qEP Kit擴增。


試劑盒包含所有必要的PCR組分,內控DNA可用于鑒定PCR抑制,或DNA抽提問題帶來的假陰性。內控DNA可直接加到PCR預混液里,或加到DNA抽提之前的樣本中。它可用于驗證DNA抽提和qPCR擴增過程。它可從Minerva廠家購買(貨號11-9905)。內控對照的擴增結果在560nm檢測(HEX通道),而支原體的擴增在520nm檢測(FAM通道)。

試劑盒包括dUTP,它替代dTTP,方便用尿嘧啶DNA糖基酶(UNG)監(jiān)視假陽性。該試劑盒不包含UNG。


實驗前準備


一、細胞培養(yǎng)篩查

細胞應長滿90%以上。細胞上清可直接用于支原體檢查,無需再樣品制備。但上清中可能累積抑制PCR的物質,此時有必要進行DNA抽提。未有證據表明,細胞培養(yǎng)基中的青鏈霉素存在抑制支原體或影響檢測的靈敏度的情況。

細胞培養(yǎng)中的支原體數量平均為1×10^6/ml,至多為1×10^8/ml,足以滿足PCR的檢測要求。PCR的模板制備如下:

1.轉移500μl細胞培養(yǎng)上清至1.5ml EP管,蓋緊蓋。

2.樣本孵育95℃10分鐘。

3.樣本最大轉速離心(15s)以沉淀細胞碎片。

4.取2μl直接用于qPCR,或樣品儲存在4℃,最多6天。長期保存在-20℃。


二、符合藥典的樣品檢查

1、濃縮樣品(可選步驟)

樣品基質可能對檢測方法的靈敏度有至關重要的影響。進一步提高檢測靈敏度的一種方法是收集和篩選比支原體DNA提取所需的更大樣本量的細胞培養(yǎng)上清(例如,Venor®GeM樣品制備試劑盒>200 μl),并執(zhí)行樣品濃縮步驟。

①轉移≤1ml樣品上清至1.5ml離心管。

②離心≥10000 × g 15分鐘(或≥13000× g  6分鐘),以沉淀支原體顆粒。

③棄掉上清,用200ml Tris緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.4)重懸沉淀。

④樣本渦旋混勻,然后直接進行樣本穩(wěn)定化處理或DNA抽提。


2.樣品穩(wěn)定化

細胞培養(yǎng)樣品可能含有高濃度的DNA酶,即使在較低的溫度下也會降解支原體DNA。因此,我們建議采取以下步驟來穩(wěn)定樣品。如果在樣品采集后立即進行DNA提取,則不需要此步驟。請注意,在樣品濃縮步驟之前,不能通過熱失活來穩(wěn)定樣品。

①轉移500ml細胞培養(yǎng)上清至1.5ml離心管。蓋上管蓋。

②95℃孵育10分鐘。

③最大速度進行樣本離心(15秒),以沉淀細胞碎片。

④樣本即可用于DNA抽提,或儲存在4℃,最多6天。長期保存在-18℃以下。


3.DNA 抽提

大量證據表明,DNA抽提可實現最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法,但應適合支原體基因組。我們推薦:

Venor®GeM Sample Preparation kits (貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動DNA抽提。

這些DNA抽提試劑盒已經過大量驗證,具體流程參見試劑盒說明書。


注意事項

??由于細胞團塊對PCR反應的負面影響,不能直接使用細胞團塊進行檢測。因此,細胞團塊,或其他生物材料,如疫苗、冷凍儲存和石蠟包埋的樣品,需要在PCR前提取DNA。

已知樣品中胎牛血清(FCS)含量(> 5%)會增加PCR抑制的可能性。為了避免假陰性結果,這些樣品可能需要在PCR之前,也需要進行DNA提取。

Venor®GeM qEP試劑盒與Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat:No. 56-1010/-1050/-1200)用于支原體DNA提取

??樣品濃縮步驟只適用于完整的支原體細胞。因此,應避免在樣品濃縮之前進行“樣品穩(wěn)定",即不能再濃縮前進行任何破壞細胞的程序(如熱失活),請參見“2.樣品穩(wěn)定化"。可直接處理體積為200 μl的樣品,無需濃縮步驟。


??Venor®GeM qEP kit包含的內控DNA對照,也用于驗證DNA抽提步驟。


??樣本濃縮時不要加內控DNA。


??內控DNA可單獨購買(貨號11-9905)。


??PCR抑制可能因樣本基質或者洗脫液產生。因而我們推薦Venor®GeM Sample Preparation kit用于DNA制備,其他品牌試劑盒需要經過試驗以保證合格。



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